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ELISA实验操作要点:如何使用ELISAcalc软件绘制标准曲线(二次曲线回归为例) 数据处理

发布时间:2023/11/7 13:38:56      阅读次数:1093

 

 

 

酶联免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作,可以简单地测出样本中有多少蛋白质、多肽、抗体,是实验室比较常用的一种检测方法。而这种简单的分析方法的核心,就是标准曲线。没有它,我们的实验就变成了一个二元的“是/不是”测试。有了它,我们可以深入研究生物反应的细节。

 

有多少人对ELISA标准曲线拟合头痛?!今天将以二次曲线回归为例,讲解如何使用ELISAcalc软件绘制标准曲线,具体实验请选择合适的拟合方式(以回归系数最接近1.0为准)

 

 


Step1:打开软件ELISACalc,界面如下:
(点击下载软件 
ELISACalc.zip

 

 

 

Step2:输入数据:

① 标准品有S1 , S2 , S3 , S4 , S5 , S6 , S7 ,7个浓度。(0孔也就是Blank值不用输入)

②“X”代表浓度/剂量,“Y”代表OD/反应值。在运行软件的X、Y列中,依次输入相对应的值,如下图所示:

 

 

 

Step3:回归/拟合 模型(M),下拉选择二次曲线回归,X数据列下拉选择对数(10为底),Y数据列下拉选择对数(10为底),如下图所示:

 

 

 

Step4:点击“回归/拟合”,显示标曲。

 

 

 

Step5:点击“回归方程”,可以得到二次曲线回归方程以及r2值等。(同一个试剂盒可以用多种方式进行拟合,例如:四参数、直线。最终根据r2值大小判断曲线的拟合程度,越接近1,拟合程度越好。)

 

 

 

Step6:标准曲线已知,并且“X”浓度/剂量 和“Y”OD/反应值是已知的。根据标准曲线求浓度,也就是“由Y计算X”,来计算样本浓度。在空格中输入样品的OD值,回车或点击“计算",即能计算对应的浓度。(点击“复制”按钮可以将结果全部复制下来,粘贴到EXCEL表格中进行下一步做图分析。)

 

 

 

 

1、二次曲线计算的结果会有两个解,要舍掉其中一个偏离度大的。

 

2、Log-logit的拟合方法是用于竞争法的,竞争法也可以用四参数或五参数的方式进行拟合。

 

3、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起。

 

4、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度,并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度,即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内,包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段,即曲线几乎成直线的范围内。

 

5、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,ELISA试剂盒这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

 

6、检测标准样品时,应按浓度递增顺序进行,以减少高浓度对低浓度的影响,提高准确性。

 

7、标准曲线的样品数一般为7个点,但至少要保证有5个点。

 

8、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动,但一般来说,相关系数R至少要大于0.98,对于有些实验,至少要0.99甚至是0.999。

 

 

要想绘制出合格的标准曲线、使用好标准曲线,真心不易,必须将各个方面的条件都考虑进去,即对标准曲线的绘制也实行质量控制,只有这样, 才能得出理想的标准曲线。

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