ELISA试验中会呈现的各种问题
发布时间：2019/6/20 12:22:44 阅读次数：726
ELISA是蛋白定量的金规范,也是免疫学研讨中常用的试验办法之一.很多人觉得ELISA很简单,其实不然.今天研域生物带你绕开ELISA试验中呈现的各种问题,轻松搞定ELISA试验~ 1.间接法检测抗体常用的办法, 首要用于对病原体抗体的检测.优势：二抗能够加强信号,并且有多种挑选能做不同的测定剖析.不加酶符号的一级抗体则能保存它多的免疫反应性.缺点：交互反应发生的机率较高2.双抗体夹心法检测大分子抗原常用的办法.优势：高活络 高专一性,抗原无须事前纯化.缺点：抗原必定得具有两个以上的抗体结合部位.3.竞争法检测小分子半抗原（药物 激素等）.优势：可适用比较不纯的样本,并且数据再现性很高.缺点：整体的敏感性和专一性都较差.常见问题剖析Q1.标曲不显色或显色很弱,样本显色溶解规范品以及倍比稀释时,未涡旋震动或不行充沛.规范品溶解 倍比稀释时均需求涡旋震动以保证充沛混匀.单纯依托移液器重复吹打,效率较低 作用也不必定jia.Q2.标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上,这样非常不利于抗原抗体之间的充沛接触,导致显色偏弱.推荐孵育阶段,运用ELISA专用的微孔板振荡器,调至适宜的频率,使抗原抗体充沛接触,保证结合作用.假如排除上述原因,有可能是漏加了某个组分,如检测抗体 酶等.关于比较大意的新手,必定要做好符号和记录,或者运用增加染料的ELISA试剂盒.Q3.标曲显色,样本不显色当样本中意图蛋白浓度极低或者样本中搅扰要素较强,就无法检测到.现在ELISA仍然是蛋白检测活络度gao的办法,与不同技能结合后,衍生出了多种类型的ELISA,提高了检测活络度.关于意图蛋白浓度特别低的样本,能够尝试用高敏ELISA,但这也并不意味着必定能检测到样本浓度,只能说能够提高样本的可测率,并使成果愈加牢靠.因为通常用一般ELISA检测的样本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高样本OD值,使之尽量位于标曲范围内,得到的数值也愈加可信.Q4.标曲和样本都显色,但复孔的CV大这个问题就跟移液器和试验者的操作有关了.移液器的运用维护不规范,就会造成移液的误差较大；试验者自身的操作习惯 加样的一致性对复孔的CV也有很大影响.掌握移液器的正确运用和维护.关于个人的操作可操练移液动作 加快速度,保证移液的精密度.Q5.本底偏高,样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下（关于高敏ELISA能够恰当放宽要求）.尤其是样本值特别低的时分,本底过高会掩盖意图信号,导致无法测到样本值.在参加TMB显色后,需实时观察标曲显se状况.通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色,即可停止反应.Q6.样本经不同梯度稀释,核算得到的样本值差异较大有时分咱们不清楚样本中意图蛋白的浓度怎么,应该怎么稀释,那么咱们就会做下预试验,确认稀释倍数.但是有时分同一样本做了几个不同梯度稀释后,核算得到的样本值之间差异较大,应该挑选哪一个稀释倍数呢？ 这里触及到了基质效应.通常血清样本加样量较高时,血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触,基质效应较显着.而经过稀释后,搅扰要素也随之稀释,影响就会较小.当某两个梯度稀释后,核算得到的样本值挨近时,咱们就能够以为在该稀释梯度时,样本中的搅扰要素影响较小,核算得到的值也是挨近真实的.但是这样的稀释是针对意图蛋白浓度较高的样本而言.关于浓度很低的样本,经过多倍稀释后,就愈加测不到了,此刻可依照厂家说明书推荐的加样方法操作.Q7.不同试剂盒中的组分能否通用除非是共用的试剂如洗液 检测缓冲液,其它组分不建议用其它试剂盒的组分,乃至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分.这些组分（包含规范品 规范品稀释液 检测抗体 酶等）都是经过优化的,假如轻率运用其它试剂盒的组分,有可能对成果产生影响.
