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1. 预期用途
本试剂盒用于定性检测植植物花叶病毒（WYMV），仅供研究使用。
2. 检测原理
试剂盒采用双抗体夹心法原理：将捕获抗体包被于酶标板上，加入样品，样品中的抗原被捕获，结合形成“抗体-抗原”免疫复合物，清洗去除游离的杂质，再加入HRP标记的酶标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-酶标抗体”夹心复合物，清洗去除多余的酶标抗原，加入TMB显色，再加入终止液，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测抗体的浓度呈正比。
3. 包含的实验材料实验材料
| 名 称 Label | 组成成分 Kit Components | 数量（48T） Quantity | 数量（96T） Quantity |
| 酶标板 | 包被板 | 8×6条 | 8×12条 |
| 阳性对照 | 阳性对照 | 1支×0.5mL | 1支×1mL |
| 阴性对照 | 阴性对照 | 1支×0.5mL | 1支×1mL |
| 酶标记物 | HRP酶标记捕获抗体 | 1支×5mL | 1支×10mL |
| 样品稀释液 | PBS、BSA等 | 1支×5mL | 1支×10mL |
| 浓缩洗液（20×） | 20倍浓缩洗液 | 1支×15mL | 1支×25mL |
| 显色剂 | 过氧化氢、TMB等 | 1支×6mL | 1支×10mL |
| 终止液 | 稀硫酸、抗沉淀剂 | 1支×3mL | 1支×6mL |
如需单独采购通用型组分，请提供对应的组分名称。
4. 需要但未包含的实验材料
· 蒸馏水或去离子水，一次性离心管、一次性手套等耗材；
· 移液器、多通道移液器及配套枪头；
· 烧杯、量筒、试剂瓶等容器具；
· 用于封贴微孔板的封板膜或其他替代材料；
· 微孔板振荡器（如有需要）、离心机、旋涡振荡器等辅助设备；
· 恒温培养箱、恒温水浴箱、酶标仪、洗板机。
5. 试剂的准备及储存
· 试剂盒各组分应储存于2~8℃保存；
· 使用前请确保试剂盒按规定的条件储存，每次实验仅准备所需实验用量的试剂；
· 1×洗液的配制：浓缩洗液（20×）如有晶体析出，需在37℃下加热至晶体全部溶解后使用。用蒸馏水1:20稀释，例如：10mL浓缩洗涤液加入190mL的蒸馏水，混合均匀。配制好的洗液可以在室温保存1周；
6. 样品采集、预处理及储存
· 样本采集：根据研究目的，使用五点取样法、随机取样法等选择有代表性的植株。统一采集相同部位（如第3-5片真叶）、相同生长阶段、相同朝向的组织。最好在一天中的固定时间（如上午9-11点）采集，以减少昼夜节律的影响。采集时使用干净（必要时用75%酒精擦拭）的剪刀、镊子、铲子等。
· 初步清洗与分类：用超纯水或去离子水快速冲洗表面泥土、灰尘。用干净的滤纸或纱布轻轻吸干表面水分。迅速分离所需组织（如根、茎、叶、果实），并去除不需要的部分（如病斑、虫咬部分）。
· 稳定化处理：将分拣好的样本立即放入预冷的液氮中，使其在数十秒内完全冻结。这能瞬间抑制所有酶活和代谢反应。在田间可用液氮罐，在实验室可用液氮杜瓦罐。样本量不宜过大，保证速冻效果。
· 研磨与均质化：
低温研磨（适用于液氮冷冻样本）：使用预冷的研钵和杵，在研磨过程中不断添加液氮，防止样本解冻。或使用高通量组织研磨仪，将样本和研磨珠放入预冷的研磨管中，在液氮冷却下或仪器自带的冷冻单位上进行研磨。
常温研磨（适用于烘干样本）：使用植物粉碎机、研磨仪或玛瑙研钵进行研磨。
注意事项：
研磨器具必须彻底清洁，防止交叉污染。不同样本间最好用酒精或超纯水清洗并擦干。
选择不会引入待测元素的研磨工具（如测定重金属时，用玛瑙或尼龙材质，避免金属材质）。
· 样本提取：取研磨好的样本粉末0.25g，加入样本稀释液250uL，充分震荡混匀，于2-8℃静置提取过夜（8-12h）。离心取上清检测。
7. 实验步骤
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右，也可置于37℃温箱快速回温至室温。
注意：酶标板未恢复室温前，请勿开封。
| 1 | 合理安排阳性对照孔、阴性对照孔、样品孔。 |
| 2 | 阳性对照孔加入阳性对照100uL，阴性对照孔加入阴性对照100uL。阴阳对照各设置2孔。 |
| 3 | 样本孔先加入样品稀释液80uL，再加入样本20uL。 |
| 4 | 盖上封板膜，在37℃下孵育30分钟。 |
| 5 | 洗板5次，最后一次洗板后弃去残留洗液，倒扣酶标板，在干净的吸水纸上拍干。 |
| 6 | 每孔加入预先配制好的酶标抗体工作液100μL。 |
| 7 | 盖上封板膜，在37℃下孵育30分钟。 |
| 8 | 洗板5次，最后一次洗板后弃去残留洗液，倒扣酶标板，在干净的吸水纸上拍干。 |
| 9 | 每孔加入显色剂100uL。 |
| 10 | 37℃下避光孵育15**分钟。 |
| 11 | 每孔加入终止液50μL。 |
| 12 | 单波长检测：使用酶标仪在450nm波长测定吸光度值； 双波长检测：使用酶标仪在450/630nm波长测定吸光度值。 |
8. 阳性判断值Cut-Off
Cut-Off =阴性对照孔平均OD值×2.1+0.1（阴性对照孔OD均值小于0.050时，按0.050计算）。
例：阴性对照孔平均OD值为0.100，则Cut-OFF值=0.100×2.1+0.1=0.310；
阴性对照孔平均OD值为0.020，则Cut-OFF值=0.050×2.1+0.1=0.205。
9. 结果判断
实验成立条件：阳性对照OD值＞1.0，且阴性对照OD值＜0.15；
阳性结果：样本OD值＞Cut-OFF值，结果判为阳性；
阴性结果：样本OD值≤Cut-OFF值，结果判为阴性；
10. 检测的局限性
样本浓度低于检出限时，检测结果无法进行准确判断。本试剂为定性试剂，不能作为定量试剂使用。
11. 产品性能指标
以下结果基于校准品的浓度值实验得出，未纳入基质效应等其他因素的潜在影响。
检测3份企业阳性参考品，结果均为阳性。检测3份企业阴性参考品，结果均为阴性。
灵敏度：0.40ng/mL（以重组抗原计）
精密度：板内精密度CV＜10%（N=20），板间精密度CV＜15%（N=20）。
特异性（Analytical specificity）：其他相关因子在稀释缓冲液中制备为10μg/mL测定，没有观察到明显的交叉反应。
