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线性范围：1.56-100 ng/mL
1. 预期用途
本试剂盒用于检测植物根、茎、叶等样本中的植物壬二酸(Azelex)浓度，仅供研究使用。
2. 检测原理
试剂盒采用双抗体夹心法原理：将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及校准品中待测物，加入辣根过氧化物酶标记的酶标检测抗体，结合形成“抗体-抗原-抗体-HRP”免疫复合物，加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本中待测物的浓度。
3. 包含的实验材料实验材料
| 名 称 Label | 组成成分 Kit Components | 数量（48T） Quantity | 数量（96T） Quantity |
| 酶标板 | 预包被捕获抗体的酶标板 | 8×6条 | 8×12条 |
| 校准品（10×） | 待测物（1000 ng/mL） | 1支×100μL | 1支×200μL |
| 酶标记物（100×） | 100倍浓缩HRP酶标记的检测抗体 | 1支×50μL | 1支×100μL |
| 通用稀释液（20×） | 样品/校准品/酶标抗体通用稀释液 | 1支×10mL | 1支×15mL |
| 浓缩洗液（20×） | 20倍浓缩洗液 | 1支×15mL | 1支×25mL |
| 显色剂 | TMB、过氧化氢 | 1支×6mL | 1支×12mL |
| 终止液 | 稀硫酸 | 1支×3mL | 1支×6mL |
如需单独采购通用型组分，请提供对应的组分名称。
4. 需要但未包含的实验材料
· 蒸馏水或去离子水，一次性离心管、一次性手套等耗材；
· 移液器、多通道移液器及配套枪头；
· 烧杯、量筒、试剂瓶等容器具；
· 用于封贴微孔板的封板膜或其他替代材料；
· 微孔板振荡器（如有需要）、离心机、旋涡振荡器等辅助设备；
· 恒温培养箱、恒温水浴箱、酶标仪、洗板机。
5. 试剂的准备及储存
· 1×洗液的配制：浓缩洗液（20×）如有晶体析出，需在37℃下加热至晶体全部溶解后使用。用蒸馏水1:20稀释，例如：10mL浓缩洗涤液加入190mL的蒸馏水，混合均匀。
1×通用稀释液的配制：用蒸馏水1:20稀释，例如：10mL的20×浓缩通用稀释液加入190mL的蒸馏水，混合均匀。
1×酶标记物工作液的配制：100×酶标抗体用“1×通用稀释液”按1:100倍稀释，例如：10uL的（100×）酶标抗体加入990uL的“1×通用稀释液”，混合均匀。配制好的1×酶标抗体工作液可以在2~8℃保存8h。
· 工作校准品的配制：校准品开封前应离心30秒，确保所有校准品集中于底部；
准备7个离心管，将10×校准品按需吸取一定量用“1×通用稀释液”稀释10倍配制成校准品S1。例：50uL的10×校准品+450uL的“1×通用稀释液”，制备得到500μL的S1浓度校准品。在随后的6个离心管中分别加入250μL的“1×通用稀释液”，在这6个试管中（S2~S7）将S1校准品依次倍比稀释6个梯度至S7，共配制7个浓度的校准品，依次为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，如下图所示。“1×通用稀释液”作为空白校准品S0。
6. 样品采集、预处理及储存
· 样本采集：根据研究目的，使用五点取样法、随机取样法等选择有代表性的植株。统一采集相同部位（如第3-5片真叶）、相同生长阶段、相同朝向的组织。最好在一天中的固定时间（如上午9-11点）采集，以减少昼夜节律的影响。采集时使用干净（必要时用75%酒精擦拭）的剪刀、镊子、铲子等。
· 初步清洗与分类：用超纯水或去离子水快速冲洗表面泥土、灰尘。用干净的滤纸或纱布轻轻吸干表面水分。迅速分离所需组织（如根、茎、叶、果实），并去除不需要的部分（如病斑、虫咬部分）。
· 稳定化处理：将分拣好的样本立即放入预冷的液氮中，使其在数十秒内完全冻结。这能瞬间抑制所有酶活和代谢反应。在田间可用液氮罐，在实验室可用液氮杜瓦罐。样本量不宜过大，保证速冻效果。
· 研磨与均质化：
低温研磨（适用于液氮冷冻样本）：使用预冷的研钵和杵，在研磨过程中不断添加液氮，防止样本解冻。或使用高通量组织研磨仪，将样本和研磨珠放入预冷的研磨管中，在液氮冷却下或仪器自带的冷冻单位上进行研磨。
常温研磨（适用于烘干样本）：使用植物粉碎机、研磨仪或玛瑙研钵进行研磨。
注意事项：
研磨器具必须彻底清洁，防止交叉污染。不同样本间最好用酒精或超纯水清洗并擦干。
选择不会引入待测元素的研磨工具（如测定重金属时，用玛瑙或尼龙材质，避免金属材质）。
· 样本提取：取研磨好的样本粉末0.25g，加入样本稀释液250uL，充分震荡混匀，于2-8℃静置提取过夜（8-12h）。离心取上清检测。
7. 实验步骤
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右，也可置于37℃温箱快速回温至室温。
注意：酶标板未恢复室温前，请勿开封。
| 1 | 编号 | 检测试验需设置校准品孔、样品孔、空白孔，合理规划各样本的排布。 |
| 2 | 稀释 加样 | 校准品孔：每孔加入校准品100uL，（S1-S7，共7个浓度）。 样品孔：每孔加入1×通用稀释液50uL，再加入提取好的样品50uL。* 空白孔：每孔加入1×通用稀释液100uL。 |
| 3 | 温育 | 盖上封板膜，在37℃下孵育60分钟 |
| 4 | 洗板 | 洗板3次，最后一次洗板后倒扣酶标板，在干净的吸水纸上拍去残液。 |
| 5 | 加酶 | 校准品孔/样品孔：每孔加入100μL酶标记物工作液。 空白孔：不加酶工作液。 |
| 6 | 温育 | 盖上封板膜，在37℃下孵育60分钟。 |
| 7 | 洗板 | 洗板5次，最后一次洗板后倒扣酶标板，在干净的吸水纸上拍去残液。 |
| 8 | 显色 | 每孔加入显色剂100uL，37℃避光显色15分钟。 |
| 9 | 终止 | 每孔加终止液 50uL。 |
| 10 | 测定 | 单波长检测：使用酶标仪在450nm波长测定吸光度值； 双波长检测：使用酶标仪在450/630nm波长测定吸光度值。 |
8. 结果计算
双波长检测结果无需进行调0，可直接进行标曲拟合及结果计算。
以下曲线拟合方式均可使用，选择拟合后r值最佳的拟合方式进行结果计算。
l 四参数逻辑（4-P）曲线拟合：以浓度值为横坐标，吸光度值为纵坐标；
l 多项式曲线拟合：2次多项式、3次多项式；
l 双对数直线拟合：以浓度值取对数，吸光度值取对数后，进行直线拟合；
l 点对点拟合：各相邻点之间分别单独进行线性拟合，分段计算；
推荐使用专业化软件进行结果拟合和计算，如ELISACALC、SPSS、Graphpad Prism等。
**最终样本浓度应乘上样本的稀释倍数。
曲线拟合方式示例图，以下数据和曲线仅供示例，与本试剂盒测定结果无关。
9. 检测的局限性
样本浓度超出检测范围上限时，应当进行适当加大稀释倍数后再次检测，计算结果应当乘上稀释倍数。样本浓度低于LOQ定量限时，检测结果无法进行准确定量。
10. 产品性能指标
以下结果基于校准品的浓度值实验得出，未纳入基质效应等其他因素的潜在影响。
灵敏度：0.91 ng/mL
精密度：板内精密度CV＜10%（N=20），板间精密度CV＜15%（N=20）。
特异性（Analytical specificity）：其他相关因子在稀释缓冲液中制备为10μg/mL测定，没有观察到明显的交叉反应。
