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磷脂酶 D（ Phospholipases D，PLD）试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
测定原理
磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在 500nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。
试剂组成和配制
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 102mL×瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 无水乙醇充分溶解。
试剂四：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。
标准品：液体 1mL×1 支，4℃避光保存。
酶液提取
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于 4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃、100000g 离心30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。
3. 血清：直接测定。
测定操作
|
| 空白管 | 标准管 | 测定管 |
| 试剂一（μL） | 20 |
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| 试剂二（μL） | 30 | 30 | 30 |
| 标准品（μL） |
| 20 |
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| 样品（μL） |
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| 20 |
| 试剂三（μL） | 10 | 10 | 10 |
| 充分混匀，30℃反应 30min，沸水浴 1min，打开盖子，自然冷却 2min。 | |||
| 试剂四（μL） | 140 | 140 | 140 |
| 30℃反应 30min，于微量石英比色皿/96 孔板，空白管调零，测定 500nm 处吸光值，分别记 为 A 标准管和 A 测定管。 | |||
酶活计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性（nmol/min/mg prot）= A测定管÷A标准管×C 标准÷Cpr÷T
= 0.017 ×A测定管÷A标准管÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性（nmol/min/g）=A测定管÷A标准管×C 标准÷W÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性（nmol/min/104cell）=A测定管÷A标准管×C 标准÷细胞数量÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性（nmol/min/mL）=A测定管÷A标准管×C 标准÷T=0.017×A测定管÷A标准管
C 标准：标准品浓度，500nmol/L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min
b. 用96孔板测定的计算公式如下
1．按照蛋白浓度计算
酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性（nmol/min/mg prot）=A测定管÷A标准管×C 标准÷Cpr÷T
= 0.017 ×A测定管÷A标准管÷Cpr
2．按照样本质量计算
酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性（nmol/min/g）=A测定管÷A标准管×C 标准÷W÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷W
3．按照细胞数量计算
酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性（nmol/min/104cell）=A测定管÷A标准管×C 标准÷细胞数量÷T
= 0.017×A测定管÷A标准管÷细胞数量
4．按照液体体积计算
酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性（nmol/min/mL）=A测定管÷A标准管×C 标准÷T=0.017×A测定管÷A标准管
C 标准：标准品浓度，500nmol/L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min
注意事项
1. 试剂三置于-20℃保存，临用前配制，配置好的试剂三置于 4℃保存不超过7天。
2. 显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。
3. 吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。
